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TALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）是一種人工工程化核酸酶，由兩部分構成：
DNA識別域（TALE蛋白）：
由 34個氨基酸的重復單元 組成，每個單元通過 第12、13位的可變氨基酸（RVDs） 特異性識別單個堿基：
| RVD類型 | 識別堿基 | 結合強度 |
|---|---|---|
| NI | A | 高特異性 |
| NG | T | 高特異性 |
| HD | C | 高特異性 |
| NN | G/A | 交叉識別 |
識別序列長度通常為 15-20 bp，確保靶向wei一性。
DNA切割域（FokI核酸酶）：
需形成二聚體才能切割DNA，因此TALENs需成對設計（左右臂），切割位點位于兩臂之間（間隔區通常為12-20 bp）。
雙鏈斷裂（DSB）：
TALE結合靶序列 → FokI二聚化 → 切割DNA雙鏈。
修復路徑：
非同源末端連接（NHEJ） ：隨機插入/缺失（Indels），導致基因敲除。
同源定向修復（HDR） ：需提供外源修復模板，實現精準插入或點突變。
技術突破：shu次實現任意基因組位點的精準切割，且脫靶率低于早期ZFN技術。
| 步驟 | 核心操作 | 創新方案 |
|---|---|---|
| 靶點設計 | 避開重復序列/甲基化區域，間隔區優化為14-18 bp | 軟件預測（TALEN Targeter）提升成功率 |
| 模塊組裝 | Golden Gate克隆法： |
6模塊串聯（+63架構）
酶切連接（BsaI/BsmBI） | 6天內完成構建，效率提升5倍 |
| 表達載體 | 哺乳動物雙啟動子載體（CMV/T7），支持細胞轉染與mRNA合成 | 適配多物種應用（斑馬魚、小鼠、人iPS細胞） |
| 活性驗證 | 酵母單雜交系統或細胞報告基因檢測 | 替代耗時ES細胞打靶，周期縮短至1周 |
| 胚胎遞送 | 受精卵顯微注射：
mRNA：TALENs體外轉錄產物
RNP復合物：TALE-FokI蛋白復合體 | RNP減少脫靶效應，提升安全性
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