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陽性細胞篩選是基因編輯的核心環節，其效率直接影響實驗周期與成功率。
核心目標
從混合細胞群中分離成功編輯的細胞（如基因敲除/KO、敲入/KI）。
排除野生型細胞干擾（未編輯細胞占比高時，易導致假陰性）。
關鍵挑戰
細胞損傷：長期篩選導致細胞老化（豬成纖維細胞傳代后增殖能力驟降）。
假陽性風險：部分編輯未wan全破壞基因功能（如移碼突變未致功能喪失）。
通量瓶頸：傳統單克隆培養需22天以上，且陽性率不足20%。
利用修復機制觸發熒光/抗性標記表達，實現可視化和快速分選：
| 修復機制 | 報告系統設計 | 篩選方法 | 優勢 | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| NHEJ | 靶向破壞熒光蛋白終止子→恢復表達 | FACS分選GFP?細胞 | 直觀高效，適用于KO | CRISPR-DIY載體 |
| HDR | 同源重組插入抗性基因（如Puro?） | 抗生素壓力篩選 | 適合KI，成本低 | 碧云天CRISPR質粒 |
| SSA | 斷裂誘導單鏈退火修復→熒光蛋白重構 | 流式細胞術 | 靈敏度高，脫靶率低 | 多重基因編輯驗證 |
操作流程（以NHEJ-GFP系統為例）：
構建含GFP-TAA終止子的編輯載體（sgRNA靶向TAA區域）。
轉染細胞后，NHEJ修復破壞終止子→GFP表達。
72h后使用流式細胞儀（如iQue?）分選GFP?細胞。
突破性方案：僅需50個細胞即可完成基因型鑒定，縮短周期15天以上。
關鍵參數：
細胞量：≥50個（20細胞組檢出率不足，P<0.01）。
酶切靈敏度：T7E1可檢測≥5%的編輯效率。
驗證步驟：Sanger測序確認突變類型（如插入/缺失）。
| 方法 | 原理 | 適用場景 | 局限 |
|---|---|---|---|
| T7E1酶切 | 錯配切割產生異源雙鏈 | 初篩（低成本） | 靈敏度低（≥5%編輯率） |
| Sanger測序 | 直接讀取序列變異 | 單克隆驗證 | 通量低 |
| 高通量測序 | 深度覆蓋靶位點突變 | 多基因/脫靶分析 | 成本高 |
操作優化：
混合克隆預篩：FA-PCR檢測群體編輯率，＞30%時再分選單克隆。
雙驗證策略：T7E1初篩陽性克隆 → Sanger測序確認（避免假陽性）。
| 細胞類型 | 推薦方法 | 理由 |
|---|---|---|
| 原代細胞 | 微量細胞鑒定法 | 避免長期培養致老化（豬成纖維細胞） |
| 腫瘤細胞系 | 抗生素篩選 + FACS | 增殖快，耐藥性穩定 |
| iPSCs | HDR報告系統 + 單克隆測序 | 維持多能性，需高精度編輯 |
| 編輯類型 | 篩選技術 | 關鍵指標 |
|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ-GFP報告系統 | GFP?細胞占比（流式定量） |
| 基因敲入（KI） | 抗生素篩選 + PCR驗證 | 抗性存活率 + 側翼序列擴增 |
| 點突變（PM） | T7E1 + 深度測序 | 突變頻率＞90% |
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