1. 微生物基因編輯常用基因編輯技術(shù)

A. CRISPR-Cas系統(tǒng)（最主流）

• 工具組成：

• Cas蛋白：常用Cas9（化膿鏈球菌）、Cas12a（更小，適合緊湊基因組）。

• sgRNA：引導(dǎo)Cas蛋白靶向特定DNA序列。

• 修復(fù)模板（HDR）：用于精確插入或替換基因。

• 優(yōu)勢：高效、多靶點編輯、適用于多種微生物。

• 適用微生物：細菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）、真菌（酵母、絲狀真菌）、古菌。

B. 傳統(tǒng)同源重組（HR）

• 原理：通過同源臂介導(dǎo)的DNA重組實現(xiàn)基因替換或敲除。

• 適用場景：CRISPR效率低的微生物（如某些乳酸菌）。

• 關(guān)鍵步驟：構(gòu)建含同源臂的線性DNA片段，電轉(zhuǎn)化或接合轉(zhuǎn)移。

C. 其他工具

• Base Editing（堿基編輯）：無需DSB，直接轉(zhuǎn)換C→T或A→G（如CRISPR-Cas9-脫氨酶融合蛋白）。

• Prime Editing：更精準的插入、缺失和點突變。

• 轉(zhuǎn)座子/噬菌體整合：適用于無高效編輯工具的微生物（如某些放線菌）。

2. 微生物基因編輯實驗流程（以CRISPR-Cas9為例）

A. 設(shè)計階段

1. 靶點選擇：

• 使用工具（如CRISPRko）設(shè)計sgRNA，避免脫靶。

• 目標序列要求：NGG PAM（Cas9）或TTTV PAM（Cas12a）。

2. 修復(fù)模板設(shè)計（如需敲入）：

• 同源臂長度：細菌（~500 bp），真菌（~1 kb）。

B. 載體構(gòu)建

• 表達系統(tǒng)：

• 質(zhì)粒載體：適合短期編輯（需抗性篩選）。

• 染色體整合：穩(wěn)定表達Cas9（如大腸桿菌BL21(DE3)-Cas9）。

• 遞送方式：

• 電轉(zhuǎn)化（細菌）、PEG介導(dǎo)（真菌）、接合轉(zhuǎn)移（難以轉(zhuǎn)化的菌種）。

C. 編輯與篩選

1. 轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染：將CRISPR組件導(dǎo)入微生物。

2. 篩選：

• 抗性標記：如卡那m素（KanR）、氯m素（CmR）。

• 表型篩選：熒光報告基因（GFP）、營養(yǎng)缺陷型補償（如leu2-）。

3. 驗證：

• PCR+測序：確認目標編輯。

• 功能驗證：如酶活檢測、生長曲線。

3. 應(yīng)用領(lǐng)域

A. 基礎(chǔ)研究

• 基因功能研究：必需基因敲除、啟動子替換。

• 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析：如細菌雙組分系統(tǒng)突變體構(gòu)建。

B. 工業(yè)生物技術(shù)

• 代謝工程：

• 大腸桿菌生產(chǎn)胰島素、琥珀酸。

• 酵母合成青h素、β-胡蘿卜素。

• 酶改造：定向進化提高酶熱穩(wěn)定性（如Taq DNA聚合酶）。

C. 醫(yī)學(xué)應(yīng)用

• 疫苗開發(fā)：減毒活疫苗（如刪除致病基因的結(jié)核分枝桿菌）。

• 抗菌策略：

• 編輯益生菌（如乳酸菌）遞送治療分子。

• 噬菌體編輯靶向耐藥菌（如MRSA）。

D. 環(huán)境修復(fù)

• 工程菌：降解污染物（如Pseudomonas編輯降解石油）。

4. 挑戰(zhàn)與解決方案

A. 編輯效率低

• 優(yōu)化方案：

• 調(diào)整Cas蛋白表達量（避免毒性）。

• 使用ssDNA修復(fù)模板（提高HDR效率）。

B. 遞送困難

• 解決方案：

• 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（真菌）。

• 噬菌體包裹CRISPR組件（針對頑固細菌）。

C. 脫靶效應(yīng)

• 控制方法：

• 高保真Cas變體（如Cas9-HF1）。

• 全基因組測序驗證。

5. 前沿技術(shù)

• 多基因編輯：同步敲除/敲入多個基因（如酵母基因組精簡計劃）。

• 無痕編輯：通過FLP/FRT或Cre-loxP刪除篩選標記。

• 體內(nèi)編輯：口服CRISPR膠囊靶向腸道菌群（如治療苯b酮尿癥）。

6. 實驗示例：大腸桿菌基因敲除

1. 設(shè)計sgRNA：靶向lacZ基因（5'-GCTATGACCATGATTACGA-3' + NGG）。

2. 構(gòu)建質(zhì)粒：將sgRNA和Cas9克隆至pTarget載體。

3. 電轉(zhuǎn)化：導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，涂布Amp平板。

4. 驗證：

• 藍白斑篩選（lacZ-菌落為白色）。

• PCR擴增靶區(qū)域并測序。