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胚胎大鼠腦神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)
1. 犧牲胎齡14-16天的SD大鼠，刮除腹部手術區(qū)域的毛發(fā)，75%乙醇全身浸泡消毒。
2. 解剖孕鼠，取出子宮并沖洗。
3. 取出胚胎，置于含有冰冷的HBSS液平皿中。
4. 手術顯微鏡下剝離出大腦半球，小心地剝?nèi)ツX膜和血管。
5. 剝?nèi)ツX膜和血管的大腦皮質(zhì)，用冰冷的HBSS液清洗三次。
6. 將大腦皮質(zhì)剪成1mm3的小塊，用1ml槍頭輕輕吹打后，使之成為細胞懸液，并通過70um的篩網(wǎng)過濾。
7. 將收集到的細胞懸液離心后，用神經(jīng)干細胞基礎培養(yǎng)液重懸，然后離心，棄掉上清液。
8. 經(jīng)計數(shù)和活力觀察，將細胞密度調(diào)至1×106/ml，以1.5×105/ml的細胞密度種入T25培養(yǎng)瓶中，同時加入FGF-2和EGF于5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，直到神經(jīng)干細胞分裂、增殖形成較大的神經(jīng)細胞球后再作傳代處理。
9. 細胞傳代，將神經(jīng)細胞球懸液移至離心管，經(jīng)低速離心后，吸棄上清液，加入神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液，用200ul槍頭吹打，使之成為單個細胞懸液，定量加入神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)液后，進行細胞計數(shù)和活力觀察。
10. 傳代后的細胞既可用來誘導分化，也可以繼續(xù)種瓶培養(yǎng)，還可以冷凍保存以備后用。
11. 神經(jīng)干細胞的分化和鑒定。
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