一、研究背景

1、臨床問題：

1）膿毒癥相關(guān)急性腎損傷（SA-AKI）占膿毒癥患者的30-50%，死亡率高達(dá)50%。

2）當(dāng)前診斷依賴肌酐和尿量，敏感性低且滯后，缺乏早期標(biāo)志物。

3）已報道的可溶性早期標(biāo)志物（NGAL、KIM-1、TIMP2、IGFBP7 等）在“亞臨床 AKI”階段靈敏度不足，且主要反映腎小管/內(nèi)皮損傷，對腎小球足細(xì)胞損傷關(guān)注不足。

2、科學(xué)基礎(chǔ)：

1）尿液細(xì)胞外囊泡（uEVs）攜帶腎臟細(xì)胞特異性分子（如足細(xì)胞、腎小管標(biāo)志物），是理想的非侵入性生物標(biāo)志物來源。

2）但uEVs高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)混合檢測易遺漏關(guān)鍵亞群信號。

二、研究方法

1、技術(shù)突破：單囊泡蛋白質(zhì)組學(xué)

1）建立鄰近依賴性條形碼檢測（Proximity-dependent Barcoding Assay, PBA）：

2）原理：用霍亂毒素B亞基（CTB）捕獲uEVs → DNA標(biāo)記抗體探針結(jié)合表面蛋白 → 滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）→ 高通量測序解碼單囊泡蛋白譜。

3）優(yōu)勢：分辨率達(dá)單個囊泡水平，可解析uEVs亞群異質(zhì)性。

2、研究隊列與實驗流程

1）篩查隊列：8例SA-AKI vs. 8例膿毒癥非AKI（PBA鑒定差異uEV亞群）。

2）驗證隊列：134例SA-AKI患者（診斷/預(yù)后評估）。

3）前瞻性隊列：72例膿毒癥患者（入院12h采樣，評估亞臨床AKI預(yù)測）。

3、多組學(xué)溯源

1）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（GSE210622）、空間轉(zhuǎn)錄組（KPMP數(shù)據(jù)庫）追溯CD35細(xì)胞來源。

2）dSTORM 超分辨成像+Western blot+nano-flow cytometry驗證蛋白表達(dá)及驗證CD35與足細(xì)胞標(biāo)志物Nephrin共定位。

4、統(tǒng)計與機(jī)器學(xué)習(xí)

1）limma 差異蛋白→ 4 種算法（RF、XGBoost、LASSO、SVM-RFE）聯(lián)合篩選標(biāo)志物。

2）ROC、KM 生存、Logistic 回歸 + 受限立方樣條評估獨立預(yù)測價值。

三、研究結(jié)果

1、發(fā)現(xiàn)CD35-uEV作為SA-AKI核心標(biāo)志物

1）篩查階段：

①PBA鑒定32個uEV亞群，其中補(bǔ)體受體簇（CMR-EV，標(biāo)志物CD35/CD21）在SA-AKI中比例顯著降低。

②單囊泡水平CD35表達(dá)下降最顯著（AUC=0.92）。

2）驗證階段：

①診斷價值：

區(qū)分SA-AKI vs. 非AKI（AUC=0.89）；

預(yù)測亞臨床AKI（AUC=0.84）。

3）預(yù)后價值：

①預(yù)測持續(xù)性AKI（AUC=0.77）、死亡風(fēng)險（AUC=0.70）、進(jìn)展至急性腎病（AKD）（AUC=0.66）。

②低CD35-uEV水平者腎臟恢復(fù)時間延長。

2、機(jī)制溯源：CD35源自損傷足細(xì)胞

1）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：CD35主要表達(dá)于足細(xì)胞，SA-AKI中表達(dá)下調(diào)。

2）空間轉(zhuǎn)錄組：損傷足細(xì)胞中CD35廣泛下調(diào)。

3）實驗驗證：94.4%的CD35? uEVs共表達(dá)足細(xì)胞標(biāo)志物Nephrin。

3、臨床轉(zhuǎn)化潛力

1）聯(lián)合診斷：CD35-uEV+腎小管標(biāo)志物TIMP2*IGFBP7→診斷AUC提升至0.87。

2）特異性：CD35-uEV在缺血性AKI（心臟術(shù)后）無變化，提示其對SA-AKI的特異性。

四、研究結(jié)論

1）標(biāo)志物價值：CD35-uEV是首個基于足細(xì)胞損傷的SA-AKI非侵入性標(biāo)志物，可用于：早期診斷（亞臨床階段）、風(fēng)險分層（嚴(yán)重度/持久性/死亡風(fēng)險）。

2）病理機(jī)制：SA-AKI存在顯著足細(xì)胞損傷（CD35下調(diào)），補(bǔ)體調(diào)節(jié)紊亂可能是關(guān)鍵機(jī)制。

3）臨床策略：腎小球（CD35-uEV）與腎小管（TIMP2*IGFBP7）標(biāo)志物聯(lián)用提升診斷精度。

五、早期靶點篩查策略：

1. 技術(shù)創(chuàng)新驅(qū)動靶點發(fā)現(xiàn)

1）單囊泡分析：解決組織異質(zhì)性（如uEVs亞群），鎖定傳統(tǒng)方法遺漏的稀有信號（如僅占1.6%的CD35?囊泡）。

2）多組學(xué)整合：

①空間轉(zhuǎn)錄組定位靶點起源（足細(xì)胞）；

②單細(xì)胞測序解析細(xì)胞狀態(tài)變化（損傷足細(xì)胞去分化）。

2、靶點篩選與驗證流程：

1）篩選及驗證流程圖：

2）關(guān)鍵步驟：

①初篩：差異表達(dá)分析（如limma包）→ 44個候選蛋白。

②精選：4種機(jī)器學(xué)習(xí)算法（隨機(jī)森林/XGBoost等）交叉驗證 → 鎖定CD35。

③驗證：多中心隊列+前瞻性隊列+外部數(shù)據(jù)庫（KPMP）。

3、臨床轉(zhuǎn)化設(shè)計要點

1）時間窗：在亞臨床期采樣（如膿毒癥入院12h內(nèi)），證明早于肌酐升高。

2）預(yù)后分層：關(guān)聯(lián)短期（AKI持續(xù)化）、長期（死亡/AKD）結(jié)局，增強(qiáng)臨床實用性。

3）組合策略：新型標(biāo)志物（CD35-uEV）與已批準(zhǔn)標(biāo)志物（TIMP2*IGFBP7）聯(lián)用，加速臨床落地。

4、差異化優(yōu)勢構(gòu)建

1）器官特異性：追溯靶點細(xì)胞起源（如足細(xì)胞），避免血液來源干擾。

2）疾病特異性：驗證靶點在其他病因AKI中的表達(dá)（如心臟術(shù)后AKI無變化），提升特異性。

總結(jié)：單囊泡分辨、多組學(xué)溯源、跨隊列驗證、聯(lián)合模型是早期篩查靶點發(fā)現(xiàn)的“黃金四要素”。